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环介导等温扩增技术专题讨论 [转自 丁香园论坛]
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发表于: 2011-8-13 17:30 作者: 嘉年华 来源: 分析测试百科网
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环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)专题讨论
所以想借PCR技术区的宝地，新开辟“环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)专题讨论”。我做LAMP一年多了，有些经验。而最近，和我谈起LAMP的朋友明显增多。所以在这方面大家有什么心得、体会、资料和实验困难，希望能一起交流讨论。谢谢支持！ 查看完整版本请点击这里：环介导等温扩增技术专题讨论 [转自 丁香园论坛]
我也来说两句
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嘉年华 (2011-8-13 17:31:45)
您好！我最近用官方软件设计了一套引物做LAMP，跑出了梯形条带，但是LAMP的最小条带比用外引物跑出来的条带要小这是什么原因啊？望指教！
嘉年华 (2011-8-13 17:37:09)
LAMP的大多数产物，是FIP和BIP扩增出来的，最小条带应该比用外引物跑出来的条带要小。如果用了环状引物，应该更加明显一些。但差别应该不明显，如果您的最小条带是<100bp，应该是引物多聚体。
如何分析条带是否是目的条带还是非特异性扩增。LAMP的扩增，是4或6对引物针对靶序列的6或8个区域，特异性是非常的好。一般只要能跑出梯形条带就能证明试验成功了。如果不放心，可在F1和B1之间选择一个内切酶酶切，能够得到特定大小条带；更保险的办法就是做个Southern杂交了。
建议再好好学习一下第一篇LAMP的文章，见NAR, 2000, 28(12):e63。
嘉年华 (2011-8-13 17:39:33)
还是有一点疑问,我指的最小条带在100bp以上,应该不是您所说的引物二聚体.不知道这样还正常吗？
另外，我看资料上的电泳图有的最前面是2条带有的是1条带，这是什么原因阿？望指教！
嘉年华 (2011-8-13 17:40:30)
应该是正常的。
电泳图有的最前面是2条带有的是1条带，这可能与电泳胶浓度有关。如果你配>2%的胶，应该看到更多条带。
嘉年华 (2011-8-13 17:40:51)
您好：
针对同一序列用官方软件设计引物的话，可以出上千条引物，请问选择引物有什么标准吗？还有我们自己选择的引物总是会出现非特异性扩增，而且不是污染造成的，请问这种情况正常吗？多谢！
嘉年华 (2011-8-13 17:41:11)
您好,我想问一下你怎么知道你的条带是非特异性扩增的条带啊?
嘉年华 (2011-8-13 17:41:45)
LAMP的扩增，是4或6条引物针对靶序列的6或8个区域，特异性是非常的好。所以出现非特异扩增的机会比PCR还要小很多，一般情况几可不考虑。
但是，LAMP的扩增效率超强，表现在两个方面：1）灵敏度比PCR高出的是数量级的差异；2）扩增产物的DNA数量，也比PCR产物高出太多，能够达到几个ug！这也是LAMP产物可以用荧光染料进行终点检测的基础。然而，优点有时候可以是缺点，太过于灵敏和产物量的巨大，使得LAMP及其容易污染！1个扩增的LAMP产物，往往又是同一片段的重复序列，因此，如果实验室一旦遭到气溶胶污染（包括实验人员！），假阳性率会很高而且难于去除！
所以，在任何进行LAMP实验前，一定就要关注污染问题。实验室分区应该比PCR更加严格！我想，LAMP最终的应用方向，应该是不开盖的检测。
嘉年华 (2011-8-13 17:42:07)
有战友PM我：
“博士您好,我今天做LAMP 的时候,反应体系中只添加内引物就能跑出梯形条带,内引物是我今天刚从原来的母液中重新稀释的.不知道这是不是说明我设计的引物有问题,跑出的是非特异性条带啊?
我的反应体系中只要内引物都加,无论外引物加一条还是两条都不加,都能跑出梯形条带,但是不加内引物,只加外引物就不能产生条带.
请博士帮我分析一下吧,谢谢了!
还有如果不是污染了,有没有可能设计的内引物就能跑出这样的梯形条带呢?很困惑,如果LAMP有非特异性扩增应该是什么样的啊? ”
我的实验结果表明，如果使用环状引物，外引物的作用就基本可被替代，尽管外引物可以加快反应速度。
“只加外引物就不能产生条带”，因为不能成环自身作为引物和模板扩增。
因此，外引物的作用相对较小。
如果是实验室污染了，只有内引物当然可以环状扩增了。我还听说过做病毒RNA的RT-LAMP，不用AMV反转录酶都扩的很好——结论只有是：扩增产物污染！
嘉年华 (2011-8-13 17:42:36)
1、针对上面的回答,我有一些疑问,如果没有使用环状引物,再出现上述情况("只要内引物都加,无论外引物加一条还是两条都不加,都能跑出梯形条带"),是不是就只有一种可能就是污染啊?
2、有没有可能在没有污染的情况下,只加内引物就能产生梯形条带 啊?
3、另外,什么叫"气溶胶污染（包括实验人员！)",实验室没有条件严格分区,只是我加体系的时候在超净台中操作.这样能避免污染吗?
谢谢了
嘉年华 (2011-8-13 17:42:58)
如果没有使用环状引物,再出现上述情况("只要内引物都加,无论外引物加一条还是两条都不加,都能跑出梯形条带")，可能性最大就是污染！因为没有环状引物或外引物，反应效率比较低，要达到同样效果的时间延长不少。
“气溶胶污染”，还真不好解释，应该是扩增产物在开盖后，挥散在空气、尘埃中和器皿、衣物、工作台、和耗材等表面。因此实验人员也是污染源之一。加体系的时候在超净台中操作，这样不能完全避免污染。至少，检测的地方要与其它实验区完全分开、扩增产物绝对不要在核酸提取和体系配制的房间开盖。
嘉年华 (2011-8-13 17:43:15)
我想问一下，要是已经出现这样的情况有什么解决的办法吗？每天用紫外灯照射房间能有效吗？
嘉年华 (2011-8-13 17:43:43)
要是已经出现污染的情况，解决办法真是不多了，可以采取：
1. 更换所有的的相关试剂；
2. 每天用紫外灯照射房间，能有一定的帮助；
3. 加强房间通风、一段时间里不要做相同的这个LAMP扩增实验；
4. 最好的办法，是更换LAMP扩增的目标区域（换引物）。
嘉年华 (2011-8-13 17:43:43)
要是已经出现污染的情况，解决办法真是不多了，可以采取：
1. 更换所有的的相关试剂；
2. 每天用紫外灯照射房间，能有一定的帮助；
3. 加强房间通风、一段时间里不要做相同的这个LAMP扩增实验；
4. 最好的办法，是更换LAMP扩增的目标区域（换引物）。
嘉年华 (2011-8-13 17:44:02)
您好!我今天拿我的菌和其它两种菌做实验都产生了梯形条带,看样子,我的实验真的是被污染了,因为我原来用外引物跑这两种菌的PCR是阴性结果的.
看了上边的讨论,很困惑.
1 把所有的相关试剂都换了,但是再操作的时候还是有可能再次被污染吧.因为空气中已经有污染源了.
2 如果污染那么容易的话,不在一屋做实验,来回走动的时候是不是也有可能被污染啊?还有白大褂是不是也要经常换啊?可是实验室没有那么好的条件,做分子的一共就一个屋,我应该怎么注意啊 ?
3 像您说的一段时间不做相同的LAMP实验,是指多长时间啊.一段时间后,污染源会自己降解吗?
望赐教
嘉年华 (2011-8-13 17:45:03)
做分子的一共就一个屋，这样的条件实在是不适合做LAMP。来回走动的时候也有可能被污染，白大褂也要经常换，不同的房间穿不同的。
你可以考虑在体系中加UNG和dUTP防污染。但对反应效率有影响。
最好考虑不开盖的检测方式。
嘉年华 (2011-8-13 17:45:03)
做分子的一共就一个屋，这样的条件实在是不适合做LAMP。来回走动的时候也有可能被污染，白大褂也要经常换，不同的房间穿不同的。
你可以考虑在体系中加UNG和dUTP防污染。但对反应效率有影响。
最好考虑不开盖的检测方式。
嘉年华 (2011-8-13 17:45:29)
lamp扩增仪用普通PCR仪和水浴锅即可。浊度计目前国内好象没有。这个反应体系并不那么节省，因为酶比PCR用的贵很多。
在普通诊所里面作常规检测，主要还是防污染的问题。
嘉年华 (2011-8-13 17:46:04)
您好,我想问一下你怎么知道你的条带是非特异性扩增的条带啊?
我们想尽了一切办法尽量排除了污染，可还是能出来梯形条带，很郁闷，没找到原因，所以就认为是
非特异性扩增
嘉年华 (2011-8-13 17:46:21)
您好，我查了一些有关ＵＮＧ方面的资料，说ＵＮＧ能消除dU化的PCR产物，可是如果像我这种情况，空气中已经存在以前未用dＵＴＰ时的扩增产物了，再使用是否还有效呢？
嘉年华 (2011-8-13 17:46:55)
空气中已经存在以前未用dＵＴＰ时的扩增产物了，再使用无效的。
不过可以控制接下来的可能产物污染。
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